PBJ_Light control of three‐dimensional chromatin organization in soybean

标题：

Light control of three-dimensional chromatin organization in soybean

期刊:

Plant Biotechnology Journal(10.1)

发表单位：

北京大学现代农业研究院

研究背景：

近年的研究揭示了表观遗传机制（包括‌DNA甲基化‌、‌组蛋白修饰‌、非编码RNA及染色质高阶结构）在调控基因表达和细胞功能中的核心作用‌。通过‌Hi-C技术‌构建的三维基因组图谱显示，染色质通过形成TADs‌、‌A/B区室‌和染色体疆域（chromosome territories，CTs）等结构，动态调控基因活性。不同于哺乳动物依赖‌CTCF/黏连蛋白复合体‌介导染色质环挤压形成TADs，植物中TADs的建立可能由‌RNA聚合酶II（RNAPII）‌驱动的转录活性协同调控‌。研究表明，RNAPII不仅参与形成跨物种保守的染色质互作域，还能通过启动子-启动子互作协调基因共表达网络。‌

大豆（Glycine max）作为全球重要油料和蛋白质作物，其三维基因组研究揭示保守染色质结构，通过组蛋白修饰调控多倍化基因表达，驱动性状演化。光信号可诱导染色质动态重塑，如核内基因重定位及异染色质压缩，并调控器官特异性转录网络（如SAURs基因簇），为解析光响应分子机制提供新视角‌。

研究材料：

5种不同光照处理的子叶、顶钩和下胚轴组织

研究方法：

测序方案：

二代Illumina RNA测序：

二代BGI Hi-C测序：446.52 - 636.34 Mb clean reads

二代Illumina CUT&Tag测序：43.81 - 68.38 Mb clean reads

分析方案：

1.                      Peak Calling 识别表观修饰区域

2.                      差异修饰分析

3.                      差异基因表达分析

4.                      功能富集（GO/KEGG）分析

5.                      三维染色体结构识别及比较：compartment、sub_compartment、TAD、loop

6.                      距离互作频率分析

7.                      ATA（Average TAD Interaction）分析

主要研究结果：

全基因组染色质组织动态受光影响

为探讨大豆幼苗在光形态建成过程中，基因组三维结构的动态变化及其在不同器官中的特异性响应。作者设计了五种光照处理条件，包括持续黑暗（cD）、生长于黑暗后转移至光照1小时（D1L）、6小时（D6L）和24小时（D24L）的处理组，以及持续白光（cL）照射组（图1a）。研究表明，大豆幼苗在光照下表现出去黄化表型，包括子叶变绿、顶钩展开等（图1b）。

为了探究光照对染色质结构的影响，作者对幼苗的子叶、顶钩和下胚轴组织进行了RNA测序，并在cD和cL下进行了Hi-C实验，每个处理包含两个生物学重复（图1c）。此外，我们在下胚轴组织中进行了一系列CUT&Tag实验，以研究组蛋白修饰对染色质结构的调控作用。

Hi-C热图显示，在黑暗和光照条件下，染色质相互作用主要集中在主对角线附近，并随着基因组距离的增加而递减（图1d左）。进一步构建的差异热图显示，光照条件下染色质相互作用显著增强（图1d中）。染色体内互作概率计算结果表明，子叶、顶钩和下胚轴的相互作用衰减指数（IDE）均为负值(图1d右)，表明染色质相互作用随基因组距离的增加而下降，并在端粒区域有所增强（图1d左）。

图1 光在染色体水平诱导染色质重排

(a)       左：用于观察大豆光形态发生的方法，包括5种生长条件：连续黑暗（cD）、连续白光（cL）或从黑暗转到光照，然后在白光下保持1小时（D1L）、6小时（D6L）和24小时（D24L）。灰色：深色处理。白光：白光处理。右图：白光的光谱组成。

(b) 4 d龄Wm82大豆在cD、D1L、D6L、D24L和cL条件下的形态比较。

(c) 采用RNA-seq、Hi-C和CUT&tag三种基因组方法对子叶、顶钩和下胚轴进行了研究。

(d) 在cD和cL条件下，使用染色质相互作用频率在100 kb分辨率下描述了下胚轴的全基因组染色质结构。左：通过比较cD和cL条件计算的全基因组Hi-C相互作用热图。对角线值设置为0。中间：将cD处理的触点与cL处理的触点排除后剩余的触点产生差分触点，以log2比率矩阵表示。右图：所有大豆染色体随着基因组距离的增加接触概率的平均缩放图。

亚区室模式反映了转录景观

空间染色体区室化在动植物中既保守又存在差异。研究表明，每条染色体可分为活跃的compartment A 区室（常染色质）和非活跃的 compartment B（异染色质）。通过PCA对Hi-C数据进行分析，识别出A和B compartment，并观察到 A/B compartment内部的染色质相互作用更强（图2a）。在光照条件下，compartment B的相互作用增强（图2a），导致整个染色体臂的染色质相互作用增加（图2b）。尽管PCA 可区分compartment A/B，但其在高分辨率下注释染色质状态的能力有限（图2c），因此需要更精细的方法。

图2 大豆染色体中存在常染色质区和异染色质区

(a)       染色质区隔化的鞍型结构（左，中）和差异鞍型结构（右），比较在cD和cL下鉴定的染色体臂内的顺式染色质相互作用。差异鞍形图（右），紫色表示与cD处理的样品相比，cL处理的样品中相互作用更多。

(b)       cD和cL处理的20条染色体的区室强度。区室强度评分由A-A和B-B相互作用数除以A-B相互作用数计算。

(c)       恒定暗处理下胚轴的16号染色体的亚室分布。第7条和第8条轨道：cD和cL期间整个染色体上A和B亚室的景观分别显示为红色和蓝色条。

通过Calder 算法，作者在黑暗和光照条件下的每种组织中鉴定出八种亚区室，包括 compartment A的四种 A sub_compartment（A.1.1、A.1.2、A.2.1 和 A.2.2）及 B sub_compartment（B.1.1、B.1.2、B.2.1 和 B.2.2）（图2c，图3a）。以cL条件下下胚轴的16号染色体为例，A sub_compartment主要分布于常染色质区域，B sub_compartment则集中于近着丝粒异染色质区域，这一现象与 H3K4me3、RNAPII Ser2P、H3K27ac 和 H3K27me3 在常染色质的富集，以及 H3K9me2 在近着丝粒高重复序列区域的修饰一致（图2c）。

RNA-seq 分析显示，A sub_compartment的转录活性显著高于B sub_compartment，并且各个亚区室的转录水平依次递减（A.1.1-B.2.2），这一趋势在所有组织样本中均保持一致（图3d）。此外，A和B sub_compartment的大小主要集中在80-90 kb之间，较大的结构域主要出现在A.1.1亚区室中（图3b、3c）。不同组织中A sub_compartment的比例存在差异，其中子叶中A sub_compartment的占比高于胚钩和下胚轴（图3a）。

进一步分析发现，光照诱导了亚区室的转换，包括A-to-B和B-to-A的变化。在黑暗向光照的过渡过程中，这种转换在所有三种组织中均被观察到，但胚钩和下胚轴的转换事件多于子叶（图3e）。基因表达水平分析显示，B-to-A转换的基因组区域中，基因的表达水平高于A-to-B转换的区域（图3f）。基因表达热图进一步表明，大多数基因在光形态建成过程中持续激活（图3g），其中B-to-A转换的sub_compartment内的光诱导基因表现出明显的组织特异性表达（图3h）。

图3 A/B 亚区的排序与大豆基因组在三种组织中的基因表达活性相关

（a）不同组织及光暗条件下亚区室比例分布‌

（b）黑暗处理子叶中亚区室数量分布

（c）黑暗处理子叶中亚区室结构域大小分布

（d）黑暗处理子叶中亚区室转录活性

（e）光暗转换中亚区室动态比例

（f）动态亚区室内基因表达水平

（g）B→A转换域内基因表达水平

每个光处理样品的表达值归一化到暗生长样品的表达水平。相对表达水平（z -score）在逐基因（逐行）的基础上通过减去平均值然后除以标准差计算。z分数的范围从−2到2。

（h）光诱导上调基因的组织特异性重叠

TADs存在于大豆子叶、顶钩和下胚轴中

作者使用hicFindTAD在5-kb分辨率下分析 Hi-C 矩阵的顺式互作，定义单个 TAD 为沿 Hi-C 矩阵对角线具有两个边界的绝缘三角结构域。在黑暗和光照条件下，每个组织中平均鉴定出11,066个TADs，大小范围从15 kb到60 kb（图4a）。量化不同光照条件下TAD边界的平均强度后，我们发现部分结构域在黑暗和光照条件下边界强度无显著差异，且结构域位置稳定（子叶：3,399个，胚钩：2,204个，下胚轴：2,204个）（图4b），其绝缘得分在两种条件下高度相似，因此被定义为保守TADs。然而，部分TADs在光刺激下形成（子叶：91个，胚钩：147个，下胚轴：87个），表现为光照下边界强度增加（图4d左）；另一些TADs在光照后消失（子叶：320个，胚钩：219个，下胚轴：582个），表现为边界强度下降。对这两组TADs进行绝缘得分分析的结果进一步支持了这一发现（图4d右）。作者将这些受光调控的TADs统称为动态光依赖型TADs。此外，研究表明，大豆基因组中包含TADs的区域相比于活跃的表观遗传标记（如 H3K27ac），更富集抑制性组蛋白修饰（如H3K27me3）。作者分析了光依赖型TADs内的组蛋白修饰，发现这些区域确实含有较高水平的H3K27me3（图4e），表明光照在不同组织中通过不同机制调控TAD的形成与维持。

图4 TAD动态与三种大豆组织中的H3K27me3相关

(a)       3号染色体上1 Mb区域（3.5–4.5 Mb）的TAD结构形态，通过 Hi-C 热图快照展示其在持续黑暗（cD）和持续光照（cL）条件下的变化。

(b) 子叶在完全黑暗和光照条件下的保守 TAD 进行聚合 TAD 分析（ATA）。TAD 的堆叠分析采用 5 kb 分辨率的 Hi-C 矩阵。富集条形图表示相对于随机背景的平均绝缘值，并按从高到低的顺序排列。
(c) 子叶中动态 TAD 边界的聚合 TAD 分析（ATA）。相较于黑暗条件，光照条件下绝缘评分更高的 TAD 被定义为获得的 TAD（Gained TADs），而绝缘评分更低的 TAD 被定义为丢失的 TAD（Lost TADs）。TAD 的堆叠分析采用 5 kb 分辨率的 Hi-C 矩阵。富集条形图表示相对于随机背景的平均绝缘值，并按从高到低的顺序排列。平均绝缘值通过计算红色方块（左上角和右下角）的信号与蓝色方块（右上角和左下角）的信号比值获得。
(d) 子叶中动态 TAD 边界的绝缘评分分布。蓝色表示持续黑暗条件下的动态 TAD，绿色表示持续光照条件下的动态 TAD。获得的 TAD（Gained TADs）和丢失的 TAD（Lost TADs）分别定义为光照条件下比黑暗条件下绝缘评分更高或更低的 TAD。获得和丢失的 TAD 边界被对齐，并标记为“0”。
(e) 三种组织中获得和丢失的 TAD 相关的组蛋白修饰热图。红色和蓝色分别表示动态 TAD 相关的组蛋白修饰的富集和缺失情况。灰色表示该组蛋白修饰在统计学上既不富集也不缺失（双侧 Mann-Whitney U 检验，P > 0.05）。

TADs是通过RNA聚合酶II在光照下激活SAURs簇而构建的

研究揭示了TADs在大豆SAURs（Small Auxin-Upregulated RNAs）基因调控中的功能后果，并发现其中一个位于12号染色体13,350–14,220 kb区间的TAD（图 5a）在光照条件下表现出动态变化，特别是在下胚轴中，该结构域在光照下比黑暗条件下更加紧密。此外，在黑暗条件下该TAD覆盖着大量处于延伸状态的RNA聚合酶II（通过RNAPII Ser2P标记显示），而光照条件下RNAPII Ser2P的峰值会降低（图 5a），并且 RNAPII Ser2P 在SAURs转录起始位点（TSS）附近增加并集中，而在光照条件下则下降并分散分布（图5b）。这些数据表明，RNA聚合酶II可能通过增强的染色质互作来协调SAURs在光照条件下的转录。

进一步分析大豆基因组中的SAURs，作者发现大豆基因组共编码244个SAURs基因，其中162个（~67%）以不同大小的簇形式存在（clustered SAURs），而77个（~33%）独立分布（individual SAURs）。相比黑暗条件，光照条件下RNAPII Ser2P在蛋白编码基因和individual SAURs基因体内的富集程度更高，但其在clustered SAURs中的分布不同（图 5b）。此外，clustered SAURs在胚钩和下胚轴中随着光照时间的增加表现出下调趋势，但在持续光照下则被上调，而子叶中未观察到类似的共表达模式（图5c）。

为了验证 RNAPII 在SAURs表达及幼苗发育中的作用，作者使用flavopiridol（FVP）抑制 P-TEFb 介导的RNAPII Ser2P磷酸化，并发现FVP处理显著抑制了4天龄幼苗的发育，尤其是下胚轴伸长和根部发育（图5d），表明转录延伸的抑制影响了幼苗发育过程中下胚轴的细胞伸长。

图5 TAD 结构中包含的 SAURs 基因簇在黑暗和光照条件下存在差异

(a) 在下胚轴中识别出的 TAD（位于 12 号染色体的 13 300–14 250 kb 区间）在持续黑暗（cD）和持续光照（cL）条件下的热图。RNAPII Ser2P 在 cD 和 cL 条件下的分布情况显示在热图下方。蓝色条（TDG）：串联重复基因。红色条（SAURs）：小型生长素上调基因。浅蓝色条（PCGs）：蛋白编码基因。

(b) RNAPII Ser2P 在 12 号染色体 13 634 172–13 876 042 bp 区间的 25 个 SAURs 基因上的分布情况。RNAPII Ser2P 在“簇状 SAURs”上的平均富集度分别以蓝色（黑暗条件）和绿色（光照条件）曲线表示。红色和粉色曲线代表背景信号，背景信号是通过在整个基因组中随机分布这些簇状 SAURs 计算得到的，分别对应 cD 和 cL 条件。转录起始位点（TSS）左侧和转录终止位点（TTS）右侧的侧翼区域长度均为 1 kb。

(c) 簇状和非簇状 SAURs 在光形态建成过程中的基因表达情况。基因表达水平以 log₂ 倍数变化（log₂foldchange）表示，范围从 -10 到 10。A-K 代表根据五种不同条件下的表达模式对 SAURs 基因进行分类的组别。热图左侧列出的是大豆 SAURs 基因 ID 及其对应的拟南芥同源基因名称。

(d) 4 天龄 Wm82 大豆幼苗在 15 μM FVP 处理下，在 cD 和 cL 条件下的形态学比较。DMSO 组：在含有 DMSO 的培养基中生长的幼苗作为对照

作者不仅观察到了SAURs簇内的染色质互作，还发现位于 46,984,580-47,109,819 区间的clustered SAURs与包含ULTRAPETALA1/2 (ULT1/2) 基因的基因组区域存在强烈的远程互作。该研究进一步揭示，在光照条件下，ULT1/2与带有 H3K27me3 标记的SAURs簇之间的染色质互作变得更加紧密（图6a）。此外，在黑暗到光照的过渡过程中，我们在全基因组范围内鉴定到数千个动态loops，这些动态环中既包括在光照下增强的环，也包括消失的环（图6b）。值得注意的是，SAURs 基因家族在动态环的锚点处富集程度最高（图6c）。作者进一步分析了动态染色质环内外的基因表达情况，结果表明，与位于动态环外的基因相比，动态环内的基因表达变异性更高（图6d）。

图6 SAURs 参与了长距离染色质互作的动态调控

(a) 12 号染色体 42–48 Mb 区域的 Hi-C 图，显示了 SAURs 基因簇（红色）和 ULT1/2（橙色）在持续黑暗（cD）和持续光照（cL）条件下的动态染色质互作。

(b) 动态长距离染色质互作的聚合峰分析（APA），包括在下胚轴中获得和丧失的染色质环。所有 20 kb 分辨率矩阵中的（染色体内）互作均被取平均值。Gained（获得）：在光照条件下比黑暗条件下具有更多互作的环。Lost（丧失）：在光照条件下比黑暗条件下具有更少互作的环。cD1 和 cD2：持续黑暗处理的两个重复实验。

(c) 在黑暗和光照条件下，所有环及动态环的基因富集分析。形状代表基因数量，形状的颜色表示富集得分。

(d) 不同时点的光照处理中，下胚轴基因表达变化的分布情况。位于环锚点的基因以红色标记，而非染色质环内的基因以绿色标记。